ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРЕСЕПСИНА В ДИАГНОСТИКЕ СЕПСИСА У ПАЦИЕНТОВ С ТЯЖЕЛОЙ ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМОЙ

Н.А. Гординская, М.Ю. Лебедев, М.В. Преснякова, ФГБУ «Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии»

Гординская Наталья Александровна – e-mail: [email protected]

Цель настоящей работы: изучение прогностической значимости различных лабораторных данных в диагностике септических осложнений при ожоговой болезни. Показано, что определение sCD14-ST (пресепсина) в крови позволяет в самые ранние сроки развития системной воспалительной реакции диагностировать активацию CD14-клеток, опережая другие показатели. Конкретные цифровые значения уровня пресепсина дают возможность дифференцировать генерализацию инфекции на фоне системного воспалительного ответа при ожоговой болезни. Ключевые слова: пресепсин; прогностическая значимость лабораторных данных; ожоговая болезнь; септические осложнения.

ВВЕДЕНИЕ

Сепсис является наиболее частой причиной летальных исходов в отделениях реанимации и интенсивной терапии и самой распространен- ной причиной шока [1]. По данным американских и европейских обзоров частота развития сепсиса колеблется от 2% у всех госпитализированных больных до 11% у больных, находившихся в палатах интенсивной терапии. Cовременный взгляд на патогенез сепсиса привел к появлению новой терминологии и диагностических крите- риев [2]. Вместе с тем проблема ранней диагностики сепсиса остается нерешенной, так как при сепсисе отсутствуют специфические симптомы и признаки. Это касается прежде всего пациентов, у которых системная воспалительная реакция развивается в силу основного заболевания, как при ожоговой болезни. Диагностика сепсиса у таких больных является особенно сложной.

ЦЕЛЬЮ НАСТОЯЩЕЙ РАБОТЫ было изучение прогностической значимости различных лабораторных данных в диагностике септических осложнений при ожоговой болезни.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Обследованы 57 пациентов с тяжелой термической травмой и с подозрением на септический процесс. Кровь на гемокультуруклассическим бактериологическим методом, используя двухфазную питательную среду (BioMereux). Молекулярную детекцию ДНК стафилококка и синегнойной палочки проводили методом полимеразно-цепной реакции с наборами «АмплиСенс» MRSA скрин-титр FL и «АмплиСенс» Pseudomonas aeruginosa скринтитр FL (Интерлабсервис). Содержание С-реактивного белка в сыворотке крови определяли на анализаторе NicoCard REDER-II (Норвегия). Для полуколичественного опреде- ления уровня прокальцитонина использовали наборы BRAHMS PCT-Q (Австрия), время анализа – 30 минут. Содержание в плазме крови фактора некроза опухоли a определяли твердофазным иммуноферментным методом с помощью тест-наборов ProCon («Цитокин», Санкт-Петербург). Содержание sCD14-ST (пресепсина) определяли c помощью иммунохемилюминесцентного экспресс-анализатора РАТHFAST (Mitsubishi Chemical Medience Corporation, Japan) и набора РАТHFAST￾PRESEPSIN, время анализа – 17 минут. Для экспериментальной модели стафилококкового сепсиса использовали 15 лабора- торных крыс породы «Вистар», массой 250 г. Для индукции генерализованной инфекции внутрибрюшинно вводили 5х108 КОЕ стафилококка № 5 коллекции ГИСК им. Л.А.Тарасевича в объеме 0,5 мл в течение трех дней. У животных ежедневно забирали кровь из подъязычной вены с целью определения содержания пресепсина. Для подтверж- дения инфекции кровяного русла у крыс заби- рали внутрисердечную кровь и методом поли- меразно-цепной реакции определяли наличие ДНК стафилококка.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 

Бактериологическое исследование крови при положительном результате анализа дает воз- можность выбора адекватных режимов антибактериальной терапии и является классиче- ским. Однако этот метод не лишен недостатков. По нашим данным у пациентов с термиче- ской травмой при подозрении на сепсис рост микроорганизмов наблюдался во второй-третьей пробе на вторые-третьи сутки от начала исследования, то есть положительная гемо- культура регистрировалась не ранее четвёртых суток от момента забора крови. Кроме того, на фоне системной антибактериальной терапииожоговой болезни рост микробов на питательных средах нередко отсутствует, что, однако, не дает права исключить инфекцию кровяного русла. Молекулярные методы детекции ДНК микроорганизмов позволяют получить результат в день исследования, но в настоящее время нет возможности обнаружения всего спектра возбудителей госпитальной инфекции.

В нашем распоряжении были наборы для определения ДНК стафилококка и синегнойной палочки, при этом выявление ДНК ацинетобактерий и энтеробактерий оста- валось невозможным. Молекулярно-генетические методы нами использовались в экспериментальной части работы при моделировании генерализованной стафилококковой инфекции у крыс. Подтверждение инфекции кровяного русла проводили ПЦР-исследованием внутрисердечной крови, забранной асептически при выведении животных из опыта. У всех опытных животных в крови обнаружена ДНК стафилококка, у контрольных – не обнаружена.

Многие исследователи рекомендуют для диагностики сепсиса использовать определение в крови количества С-реактивного белка (СРБ). СРБ – острофазный белок, самый быстрый и чувствительный индикатор повреж- дения тканей при воспалении, некрозе, травме. В сыворотке здоровых людей С-реактивный белок практически не определяется. При термической травме уровень СРБ повы- шается до нескольких сотен мг/мл [3].

В дальнейшем регистрируется снижение количества СРБ с возможными подъемами в разные пери- оды ожоговой болезни. По литературным дан- ным у пациентов с термической травмой и подозрением на генерализацию инфекционно- го процесса в остром периоде ожоговой болезни концентрация СРБ составляет от 102 до 261 мг/мл, в среднем 153±56 мг/мл. Нами получены идентичные результаты, уровень СРБ составил 150±67 мг/мл, однако цифровые значения количества СРБ для прогноза развития сепсиса на фоне термической травмы определить не удалось.

В последнее десятилетие, с учетом новых данных о патогенезе многих заболеваний и состояний, сопровождающихся системной вос- палительной реакцией, широко обсуждаетсяопределение уровня про- и противовоспали- тельных цитокинов. Цитокины играют ведущую роль в развитии системного воспаления любой этиологии, выступая индукторами и регуляторами иммунного ответа. Они обладают широким спектром биологического действия, проявляющегося в многообразных изменениях метаболизма, гемопоэза, свойствах сосудистой стенки и функции регулятор- ных систем.

Вне воспалительной реакции и иммунного реагирования цитокины в крови содержатся в очень малом количестве, усиление их синтеза начинается в ответ на проникно- вение микроорганизмов или повреждение тканей. Как показали результаты наших исследова- ний, наиболее важным для пациентов с тяжелой термической травмой является определение фактора некроза опухолей-a (ФНО-a), так как наблюдается многократное увеличение содержания цитокина в плазме крови соответственно тяжести травмы и развитию осложне- ний. Через сутки после травмы уровень ФНО-a в периферической крови достоверно разли- чался в зависимости от площади ожога и при развитии инфекции: в I группе (ожог до 45% п.т.) уровень составил 354,7±60,6 пкг/мл, во II группе (ожог свыше 45% п.т.) – 752,6±40,7, в III группе (ожог+сепсис) – 938,6±57,1 пкг/мл. На третьи сутки после травмы у пациентов без инфекции регистрировалось снижение концентрации цитокина, а при развитии сепсиса уровень ФНО-a продолжал нарастать и составил 12936,4±2140,1 пкг/мл.

Таким образом, уровень ФНО-a в плазме крови отражает тяжесть термического поражения и позволяет диагностировать развитие сепсиса на фоне термической травмы. Вслед за провоспалительными цитокинами при системной воспалительной реакции и сеп- сисе в кровотоке появляется прокальцитонин. Прокальцитонин (РСТ) представляет собой полипептид с м.м. 14,5 кДа, который является неактивным предшественником кальцитонина. В норме РСТ образуется из препрокальцитонина в С-клетках щитовидной железы под действием кальций-зависимых факторов. У здоровых людей весь образующийся РСТ преобразуется в кальцитонин и практически отсут- ствует в кровотоке.

При генерализованных бактериальных инфекциях, тяжелых травмах,ожогах, кардиогенном шоке, продолжительных нарушениях микроциркуляции, то есть при системной воспалительной реакции орга- низма происходит повышение РСТ в крови. При этом имеет место экстратиреоидный синтез РСТ в лейкоцитах, нейроэндокринных клетках легких, кишечника и печени [4].

Основными индукторами синтеза прокальцитонина явля- ются бактериальные эндотоксины и провоспа- лительные цитокины. Полученные нами результаты полуколиче- ственного определения прокальцитонина у пациентов с термической травмой и подозрением на генерализацию инфекции показали, что в 40% случаев развития сепсиса содержа- ние РСТ в крови оценено как ложноотрица- тельный результат. Значения РСТ при этом не превышали 0,5 нг/мл. В настоящее время появилась возможность определения уровня гуморального белка пре- сепсиса, выделяющегося при активации фаго- цитирующих клеток.

Как известно, в результате связывания липополисахаридсвязывающего белка (ЛСБ) с компонентами бактериальной клетки (липополисахиридом грамотрицатель- ных или пептидогликаном/липотейхоевыми кислотами грамположительных микроорганизмов) начинается быстрая активация мембранного белка макрофагов mCD14, передаю- щего сигнал толлподобным рецепторам, кото- рые, в свою очередь, являясь трансмембран- ными рецепторами, передают сигнал о бактериальной инфекции внутрь макрофагов. После выполнения сигнальной функции рецептор mCD14, утрачивая мембранный «якорь» (гли- козилфосфатидилинозитол), отсоединяется от мембраны клетки и выходит в циркуляцию как sCD14. В 2005 г. в крови септических пациентов была обнаружена ранее неизвестная форма sCD14. Было выявлено, что под действием циркулиру- ющей протеазы (катепсина D) от sCD14 отще- пляется пептидный фрагмент, в результате чего образуется укороченная форма рецептора, пер- воначально названная субтипом sCD14-ST, а затем переименованная в пресепсин [5]. Пресепсин (ПСП) – это белок с молекулярной массой 13 кДа, содержащий N-терминальный фрагмент CD14 и не содержащий С-терминаль- ный участок. Модельные эксперименты на животных показали, что воспаление,индуцированное с помощью препаратов ЛПС, не сопровождалось повышением уровня ПСП в крови, а сепсис, моделированный введением жизнеспособных бактерий, вызывал значи- тельный рост концентрации пресепсина. Повышение уровня пресепсина при этом заре- гистрировано уже через 1,5 часа, интерлейкина-6 – через 3 часа, а повышение содержания прокальцитонина – через 6 часов [6]. Нами проведено исследование содержания sCD14-ST (пресепсина) c помощью иммуно- хемилюминесцентного экспресс-анализатора РАТHFAST (Mitsubishi Chemical Medience Corporation, Japan) у 15 экспериментальных животных с моделью генерализованной ста- филококковой инфекции и 26 пациентов с тяжелой термической травмой и подозрением на генерализацию инфекции. Содержание пресепсина у крыс контрольной группы во все сроки наблюдений оставалось нулевым. Уровень пресепсина в опытной груп- пе животных представлен на рисунке.

РИС. Уровень пресепсина в опытной группе животных.

 

 

 

 

 

 

 

 

У 17 больных из числа обследованных содержание пресепсина было выше 500 пкг/мл (от522 до 2285 пкг/мл), что по инструкции к тесту является значимым для диагностики сепсиса. При этом уровень прокальцитонина был выше 10 нг/мл только у 5 человек, положительная гемокультура зарегистрирована у 11 (таблица). Таким образом, определение sCD14-ST (пресепсина) в крови пациентов с тяжелой терми- ческой травмой и подозрением на септический процесс в 100% случаев позволило подтвер- дить клинический диагноз.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

«Золотым стандартом» диагностики сепсиса является микробиологическое исследование крови, но бактериологический посев крови

ТАБЛИЦА. Уровень ПСП и ПКТ

требует значительных затрат времени, а отрицательные результаты при этом не исключают сепсис. Динамическое наблюдение за содержанием СРБ у тяжелообожженных дает возможность оценивать тяжесть состояния пациентов, одна- ко количественные критерии, позволяющие улавливать изменения в условиях системной воспалительной реакции основного заболевания, отсутствуют.

Недостатком при изучении уровня цитокинов является невозможность быстрого определе- ния показателя у одного больного, т. к. использование наборов для иммуноферментного метода требует накопления проб крови для целого планшета. Литературные данные сравнительных исследований показывают, что полуколичественный экспресс-тест РСТ, используемый чаще всего в клиниках, не всегда показывает результаты, идентичные полученным, с помощью высоко- чувствительных, но, к сожалению, малодоступ- ных количественных методов. Определение sCD14-ST (пресепсина) в крови позволяет в самые ранние сроки развития системной воспалительной реакции диагностировать активацию CD14-клеток, опережая другие показатели. Конкретные цифровые значения уровня пресепсина дают возможность дифференцировать генерализацию инфекции на фоне системного воспалительного ответа при ожоговой болезни.

ЛИТЕРАТУРА

1. Алексеев А.А., Крутиков М.Г., Бобровников А.Э. Сепсис у обо- жженных: вопросы диагностики, профилактики и лечения. Инфекции и антимикробная терапия. 2001. № 3 (3). С. 74-76. Alekseev A.A., Krutikov M.G., Bobrovnikov A.E. Sepsis u obozhzhonnykh: voprosy diagnostiki, profilaktiki i lecheniya. Infekcii i antimikrobnaya terapiya. 2001. № 3 (3). S. 74-76.

2. Руднов В.А. Сепсис: современный взгляд на проблему. Клиническая антимикробная химиотерапия. 2000. № 2 (1). С. 4-11. Rudnov V.A. Sepsis: sovremeniy vzglyad na problem. Klinicheskaya antimikrobnaya khimioterapiya. 2000. № 2 (1). S. 4-11.

3. Jeschke M.G., Finnerty C.C., Kulp G.A et.al. Can we use C-reactive protein levels to predict severe infection or sepsis in severely burned patients? Int J. Burn Trauma. 2013. № 3 (3). Р. 137-143.

4. Sexton P.M., Christopoulos G., Christopoulos A. et al. Procalcitonin has bioactivity at calcitonin receptor family complexes: potential mediator implications in sepsis. Crit Care Med. 2008. № 36 (5). Р. 1637- 1640.

5. Shozushima T., Tacanashi G., Matsumoto N. et.al. Usefulness of presepsin (sCD14-ST) measurements as a marker for the diagnosis and severity of sepsis that satiafied disgnostic criteria of systemic inflammatory response syndrome. J. Infect Chemother. 2011. № 17 (6). Р. 764-769.

6. Вельков В.В. Пресепсин – новый высокоэффективный биомаркер сепсиса. Клинико-лабораторный консилиум. 2012. № 2. С. 56-62. Vel’kov V.V. Presepsin – noviy vysokoeffektivniy biomarker sepsisa. Kliniko-laboratorniy konsilium. 2012. № 2. S. 56-62